Вы здесь

Главная

Замены аминокислотных остатков в катионном центре неорганической пирофосфатазы Escherichia coli

ID_Статьи: 
75.00

Неорганическая пирофосфатаза (Е-РРаза) является ферментом, катализирующим гидролиз неорганического пирофосфата до ортофосфата, тем самым, обеспечивая синтез важнейших биополимеров in vivo. Фермент является металлозависимым и состоит из шести одинаковых субъединиц в каждой из которых есть активный центр, связывающий субстрат - MgPPi. Недавно был обнаружен еще один центр - эффекторный, в котором связывается неорганический пирофосфат (PPi) или его аналог метилендифосфонат (РСР), что приводит к активации фермента. Актуальной задачей является поиск путей локализации этого центра.

Зная, что в эффекторном центре связывается отрицательно заряженный лиганд, анализом поверхности белка найден катионный кластер, образованный Lys 146, Lys 148, Lys 115 и Arg 43. Были получены генно-инженерные конструкции для следующих мутантных Е-РРаз: К115А, K148Q и R43Q. Мутантные белки выделены. В отличие от нативного фермента кинетика гидролиза субстрата при рН 7,5 всеми мутантными вариантами не может быть описана уравнением Михаэлиса-Ментен, что в двойных обратных координатах формально выражается в наличии двух наклонов, соответствующих низким и высоким концентрациям субстрата. Этот факт свидетельствует об ослаблении сродства PPi к эффекторному центру. Кинетические параметры гидролиза изменились: активность вариантов К115А и K148Q в оптимальных условиях в 2-5 раз ниже активности нативной Е-РРазы, в то время как вариант R43Q практически неактивен (величина максимальной скорости гидролиза снижена на 2 порядка). Сродство к субстрату у всех полученных Е-РРаз того же порядка, что и у нативного фермента. Данные мутации мало повлияли на сродство ионов Mg в центре М2, но отразились на сродстве к центру М4. Для всех мутантных белков характерна большая термическая стабильность, и утрата в стандартных условиях способности образовывать тримеры и димеры.

 

Ситник Т.С.1, Аваева С.М.2

1МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет, Москва (Россия)

2Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Москва (Россия)