Вы здесь

Главная

Взаимодействия доменов репликативного белка А с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации

ID_Статьи: 
20.00

Проведен ряд экспериментов по изучению способа связывания репликативного белка A (RPA) с одноцепочечными олигонуклеотидами различной длины, а также частичными ДНК-дуплексами, моделирующими структуру ДНК на различных этапах репликации. Был использован метод ограниченного протеолиза белка специфической протеазой в присутствии частичных дуплексов ДНК, несущих в своей структуре 5'-выступающий одноцепочечный участок, или одноцепочечных олигонуклеотидов сравнимой длины. Увеличение устойчивости RPA к действию протеаз можно обнаружить при его связывании с ДНК-дуплексом, несущим 5'-выступающий участок в 5 нуклеотидов, хотя картина протеолиза RPA в присутствии одноцепочечных ДНК размером 5-9 нуклеотидов практически не отличается от таковой для свободного белка. Эффективная защита характерных протеолитических сайтов наблюдается при связывании с одноцепочечными ДНК размером более 16 нуклеотидов, в то время как взаимодействие с ДНК-дуплексом, несущим 5'-выступающий участок размером в 9 нуклеотидов, уже приводит к аналогичным эффектам. Данные по блокаде определенных протеолитических сайтов позволяют предложить модель специфического способа взаимодействия RPA с переходом «одноцепочечная ДНК- двуцепочечная ДНК». Для определения роли белковых доменов при таком способе взаимодействия мы применили комбинацию методов фотоафинного мечения и ограниченного протеолиза с последующей идентификацией продуктов. Результаты работы указывают на то, что ДНК связывающие домены С (аминокислотные остатки 432-616 субъединицы RPA70) и Д (аминокислотные остатки 43-171 субъединицы КРАЗ 2) участвуют в обнаруженном виде взаимодействия.

 

Пестряков П.Е.1, Вайсхарт К.2, Ходырева С.Н.1, Насхойер Х.П.2, Лаврик О.И.1

1Новосибирский институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск, 630090;

2Институт молекулярной биотехнологии, Йена, D-07745, Германия