Вы здесь

Главная

Влияние последовательности на границе пролин богатого района (ПБР) и А А-спирали на свойства цитохрома р450 1а2 человека

ID_Статьи: 
70.00

Сочетание методов гетерологичной экспрессиии и сайт направленного мутагенеза является основным подходом для изучения структурно-функциональных отношений в молекулах цитохромов Р450. Нами создан набор конструкций для экспрессии Р450 человека (CYP1A2) с С-концевой тетрагистидиновой последовательностью в клетках Е. coli и S. cerevisiae. Полученные конструкции обеспечивали синтез полноразмерных белковых продуктов с выходом спектрально-активного препарата на уровне 200 - 400 нмоль/л культуры в штаммах Е. coli и 40 - 60 нмоль/л культуры в клетках дрожжей. Оптимизированы этапы экспрессии, разработана процедура аффинной очистки белков на сорбенте NI-IDA. Концевая модификация тетрагистидином не влияет на каталитические свойства бежа в реакции О-деметилирования 7-МРФ.

Для изучения мембранной топологии CYP1A2 создана плазмида рАХА, содержащая введенный сайт узнавания эндопептидазой фактором ХА на границе мембранного и цитозольного доменов. Мутация представляет замену 12-ти аминокислотных остатков, снижающую уровень гидрофобности в районе между ПБР и А спиралью. Для эффективной экспрессии рАХА потребовалась дополнительная добавка микроэлементов. Рекомбинантный аналог CYP1A2 с введенным сайтом узнавания фактора Ха на границе ПБР и А-спирали обладает измененными энзиматическими свойствами по сравнению с немодифицированным ферментом. При этом возникает новая субстратная специфичность в отношении 7-ПРФ и 7-БРФ и негиперболическая зависимость между скоростью реакции О-деметилирования и концентрацией маркерного субстрата 7-МРФ.

 

Жгун А.А.1, Эльдаров М.А.1, Солодарь Л.И.2, Соколов Н.Н.2, Петушкова Н.А.2, Скрябин К.П.1

1Центр "Биоинженерия" РАН, Москва, Россия

2Институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН, Москва, Россия