Вы здесь

Главная

Влияние последовательности на границе пролин богатого района (ПБР) и а-спирали на свойства цитохрома Р450 1А2 человека

ID_Статьи: 
50.00

Сочетание методов гетерологичной экспрессиии и сайт направленного му­тагенеза является основным подходом для изучения структурно-функциональ­ных отношений в молекулах цитохромов Р450.Нами создан набор конструк­ций для экспрессии Р450 человека (CYP1A2) С С-концевой тетрагистидиновой последовательностью в клетках Е. coli и S. cerevisiae. Полученные конструк­ции обеспечивали синтез полноразмерных белковых продуктов с выходом спек­трально-активного препарата на уровне 200-400 нмоль/л культуры в штаммах Е. coli й 40-60 нмоль/л культуры в клетках дрожжей. Оптимизированы этапы экспрессии, разработана процедура аффинной очистки белков на сорбенте N1-IDA. Концевая модификация тетрагистидином не влияет на каталитические свойства белка в реакции О-деметилирования 7-метоксирезоруфина.

Для изучения мембранной топологии CYP1А2 создана плазмида рАХА, содер­жащая введенный сайт узнавания эндопептидазой фактором ХА на границе мембранного и цитозольного доменов. Мутация представляла замену 12гти, ами­нокислотных остатков, снижающая уровень гидрофобности в районе между ПБР и а-спиралью. Для эффективной экспрессии рАХА требовалась дополнительная добавка микроэлементов. Значительная часть гемового железа мутанта находи­лась, по сравнению с контролем, в низкоспиновой форме, которая была способна переходить в высокоспиновую при инкубации с субстратом 7-метоксирезору-фином с восстановлением каталитических свойств.

 

Жгун А.А.1, Эльдаров М.А.1, Солодарь Л.И.2, Соколов Н.Н.2, Петушкова Н.А.2, Арчаков А.И.2, Скрябин К.Г.1

1 Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

2 Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН, Москва