Вы здесь

Главная

Супераффинная модификация биополимеров. каталитически компетентное мечение РНК-зависимой РНК-полимеразы вируса гриппа А

ID_Статьи: 
72.00

Афинная модификация относится к одному из эффективных методов изуче­ния структур биополимеров. Метод включает в себя доставку химически ак­тивной группы, входящей в структуру аффинного реагента, к активному центру белка или к специфической последовательности нуклеиновой кислоты. В мно­гокомпонентных системах применение этого метода ограничено возможноетью неспецифической реакции реагента с биополимерами. Для увеличения спе­цифичности разработаны специальные подходы: метод каталитически компе­тентного мечения ферментов; модификация белков с переносом энергии через триптофан и модификация белков и нуклеиновых кислот с использованием бинарной системы аффинных реагентов.

Мы использовали метод каталитически компетентного мечения для иденти­фикации праймер-связывающего центра в структуре РНК-полимеразы вируса гриппа А. Рибонуклеопротеин вируса (RNP), состоящий из вирусной РНК в ком­плексе с трехсубъединичной РНК-полимеразой и РНК-связывающим белком (NP), инкубировали с производным AMP, несущим альдегидную группу. После добавления боргидрида натрия реагент образовывал ковалентную сшивку с ос­татками лизина всех белков, входящих в структуру рибонуклеопротеина. После­дующее добавление [a-32P]GMP приводило к синтезу меченого динуклеотида, ковалентно связанного с активным центром РНК-полимеразы. Другие остатки реагента не присоединяли меченного нуклеотида и оставались «невидимыми» в ходе последующего анализа. Было показано, что по такой схеме метится ис­ключительно большая субъединица РНК-полимеразы (РВ1). Частичный протео-лиз РВ1 позволил выявить пептидный фрагмент 1179298, как единственный не­сущий метку. Мы заключили, что один из остатков лизина в этом фрагменте участвует в формировании праймер-связывающего центра РНК-полимеразы. В случае прямой модификации RNP реакционноспособным динуклеотидом ос­новным меченым белком был NP.

 

Колпашиков Д.М., Ишихама А.

Национальный институт генетики, (Япония)