Вы здесь

Главная

Создание векторов для бактериальной экспрессии гена делеционного мутанта hIL-13д2а. оптимизация 5-конца кодирующей последовательности интерлейкина-13 человека для его биосинтеза в Е. coli

ID_Статьи: 
171.00

р-Спиральные цитокины, к которым относятся интерлейкины-2, -4 и -13, ГМ-КСФ, Г-КСФ и ряд других белков, имеют сходные пространственную структуру белковых молекул и экзон-интронную структуру кодирующих их генов.

Ранее было показано наличие у мРНК интерлейкина-4 (IL-4) альтернативно­го сплайсинга, приводящего к делеции второго экзона. Транслируемый с такой укороченной мРНК делеционный мутант (IL-4д2) оказался тканеспецифичес-ким природным антагонистом IL-4. Природные антагонисты IL-2д2 и IL-2дЗ, в мРНК которых в результате альтернативного сплайсинга отсутствали второй и третий экзоны, соответственно, были обнаружены и для интерлейкина-2.

Хотя наличие аналогичных природных делеционных вариантов для интер­лейкина-13 (IL-13) показано не было, такой белок, будучи получен искусственно, может обладать свойствами антагониста IL-13. Известно, что интерлейкин-13 играет важную роль в развитии аллергических процессов, поэтому получение его антагониста может иметь терапевтическое значение.

С помощью полимеразной цепной реакции получен новый гибридный ген Ш362А с отсутствующим вторым экзоном гена интерлейкина-13 человека. На основе этого гена и векторов рЕТ-20Ь и pET-23d созданы векторы pET-pelB-IL-13д2А и рЕТ-IL-13д2А5 обеспечивающие биосинтез секретируемого и внутрикле­точного вариантов делеционного мутанта IL-13д2А.

С целью повышения АТ-состава и оптимизации используемых кодонов для биосинтеза в Е. coli первые 33 нуклеотида кодирующей последовательности зрелого природного интерлейкина-13 человека, помещенной в вектор pET-23d, были заменены с помощью синтетического олигонуклеотидного дуплекса и таким образом получен вектор pET-IL-13*. На основе его и нового гена illЗд2А создан вектор рЕТ-IL-13д2А*, содержащий ген illЗд2А с оптимизированным для бакте­риальной экспрессии 5'-концом.

Изучена экспрессия полученных новых генов в штаммах Е. coli BL21(DE3) и AD494(DE3).

 

Топорова В.А., Петровская Л.Е., Крюкова Е.А., Коробко В.Г.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН, Москва