Вы здесь

Главная

Создание базы данных последовательностей кДНК куриных В-лимфоцитов

ID_Статьи: 
6.00

Культура куриных В-лимфоцитов DT40 представляет собой клетки, модифицированные вирусом лейкоза птиц, постоянно пребывающие в стадии развития, соответствующей стадии фабрициевой сумки, являясь, таким образом, удобной моделью для изучения процессов созревания генов антител. Отношение направленной интеграции гомологичных последовательностей в геном DT40 к случайной составляет 1:1 за счет сохранения клетками высокой рекомбинационной активности. В культурах клеток млекопитающих эта величина варьирует от 1:100 до 1:1000.

Для исследования регуляции созревания генов антител на базе DT40 хорошо применима техника «отключения генов» (gene knockout). Этот метод используется для поиска генов, ответственных за процессы, вовлеченные в перестройку генов антител, как то: рекомбинацию ДНК, генную конверсию, а также за различные виды репарации в куриных В-лимфоцитах. Использование метода «отключения генов» требует как можно более полной базы данных, содержащей последовательности генов, экспрессируемых в В-клетках. В связи с этим целью работы было создание базы данных путем секвенирования клонов из библиотеки кДНК куриных В-лимфоцитов Rikenl. Для секвенирования были отобраны клоны, содержащие старт-кодон, и не являющиеся известными куриными генами, также секвенируемые клоны не должны были повторяться. Отбор проводился путем сравнения последовательностей из полученной базы данных по 5'-EST для Rikenl с базой данных SwissProt.

Секвенирование проводили по методу Сенгера на автоматическом секвенаторе фирмы ABI с использованием флуоресцентно меченых дидезокситерминаторов.

Из 112 проанализированных на первом этапе работы последовательностей 13 были родственны известным куриным генам, 78 содержали консервативные области. Наибольший процент гомологии (74%) был выявлен для белка, распознающего сигнальную последовательность рекомбинации (RSS recognition protein).

Созданная в дальнейшем база данных последовательностей кДНК куриных В-лимфоцитов (несколько тысяч последовательностей) применима для:

- создания конструкций для генного нокаута в DT40

- экспресии куриных генов в клеточных культурах

- поиска куриных генов, гомологичных генам других модельных организмов, а также генов, уникальных для курицы

- анализа последовательностей 5'-нетранслируемых областей.

 

 

Благодатский А.С.1, Беззубов Ю.И.2, Калдуэлл Р.3, Бурштедде Ж.М.3

1Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, Москва (Россия)

2МГТУ им. Баумана, Москва (Россия)

3Институт молекулярной радиобиологии, Национальный исследовательский Центр по защите окружающей среды и здоровья, Мюнхен (Германия)