Вы здесь

Главная

Получение суперпродуцентов неорганических пирофосфатаз E. coli и Т. thermophilics

ID_Статьи: 
30.00

Синтез макромолекул в клетках живых организмов сопровождается образованием большого количества пирофосфата, который накапливается за счет гидролиза нуклеозидтрифосфатов при присоединении каждого мономера. Избыток пирофосфата в реакционной среде сдвигает равновесие биохимических реакций и может привести к распаду образующихся полимеров. In vivo эта проблема решается за счет присутствия в клетке неорганической пирофосфатазы, эффективно гидролизующей пирофосфат. Было предложено использовать неорганическую пирофосфатазу in vitro для повышения эффективности синтеза макромолекул, в частности, при транскрипции. Этот фермент можно применять также и в ПЦР для повышения эффективности синтеза ДНК. Но в этом случае фермент должен обладать термостабильностью, т.к. одним из этапов ПЦР является прогревание реакционной смеси до 93-97°С. Целью работы явилось получение штаммов-суперпродуцентов неорганических пирофосфатаз Е. coli и Т. thermophilus, а также выделение и очистка рекомбинантных белков. Пирофосфатаза Т. thermophilus - термостабильный фермент, выдерживающий длительное прогревание при высоких температурах, который успешно может использоваться при ПЦР амплификации.

Были созданы генетические конструкции для экспрессии генов пирофосфатаз Е. coli и Т. Thermophilus в штамме Е. coli BL21 (DE3)pLysS, на основе которых получены эффективные суперпродуценты этих ферментов. Разработана методика двухстадийной очистки неорганических пирофосфатаз, включающая прогрев до 80°С и хроматографию на DEAE-sephacel. Ферменты очищены до функционально чистого состояния. Выход пирофосфатазы Е. coli после очистки составил 100 мг с литра культуры, пирофосфатазы Т. thermophilus - 30 мг с литра культуры. Определены удельные активности неорганических пирофосфатаз Е. coli и Т. thermophilus, составляющие около 1400 ед/мг белка и 2000 ед/мг белка соответственно.

 

Коледачкина Т.Ю., Матвиенко Н.И.

Институт белка, Пущино (Россия).