Вы здесь

Главная

Получение и тестирование миниантител к белку вирулентности агробактерий VirE2

ID_Статьи: 
4.00

Агробактериальный белок вирулентности VirE2 выполняет ряд важных функций при агробактерильной трансформации растений, в частности, входит в состав Т-комплекса, защищая от эндонуклеаз и, предположительно, участвует в транспорте Т-ДНК через мембрану и цитоплазму растительной клетки. Целью данного исследования было получение и мечение антител к VirЕ2-белку для последующего его детектирования in vitro и in vivo.

Антитела к VirЕ2-белку получали, используя библиотеку scFv-антител в нитевидных фагах, созданную в ФИБХ РАН в группе молекулярных аспектов иммунологии репродукции (Ламан А.Г. с соавт., 2001). Библиотека мышиных "миниантител" scFv, экспрессируемых в составе белка gp3 бактериофага fd, создана в фагмиде pHENl в штамме E.coli TG1. Отбор клонов фага, специфически связывающихся с VirE2, проводили путем последовательных раундов истощения библиотеки белком, иммобилизованным на плашке. Связавшиеся вирионы элюировали, осуществляли ими трансфекцию E.coli и проводили следующий раунд истощения библиотеки. Отобранные фагмиды с генами антител к VirЕ2-белку трансфецировали в клетки Е. coli JS5 из которых выделяли "растворимые" scFv-антитела. Выход миниантител составлял около 1 мг с 1 литра культуры.

Для выявления VirЕ2-белка использовали метод иммунодота и иммуноблота при помощи миниантител в трех вариантах: 1) коньюгированных напрямую с коллоидным золотом, 2) моноклональными антителами к пептиду 9Е10 и соответствующими вторичными антителами, меченными пероксидазой хрена, 3) фагами (М13), выявляемых антифаговыми антителами и коллоидным золотом, коньюгированным с протеином А. Наилучшие результаты были получены в 3-м варианте.

 

Мозжилина О.В.1, Беликов В.А.1,2, Широков А.Л.1, Волохина И.В.1, Рожок Н.А., Дыкман Л.А.1, Чумаков М.И.1

1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г.Саратов

2Филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино