Вы здесь

Главная

Охарактеризация мутантного варианта Е50К рекомбинантного Fab-фрагмента антитела против 2,4-дихлорофенокси-уксусной кислоты

ID_Статьи: 
74.00

Настоящая работа посвящена направленному изменению аффинности рекомбинантного Fab-фрагмента антитела с применением методов белковой инженерии в сочетании с молекулярным моделированием структуры.

Ранее по первичной последовательности антитела была смоделирована структура вариабельных фрагментов антитела Е2/В5 против 2,4-дихлорофенокси-уксусной кислоты (2,4Д). На поверхности антитела в сайте связывания лиганда был выделен остаток глутаминовой кислоты Е50. Благодаря данному остатку свободная отрицательно заряженная молекула 2,4Д связывалась с антителом хуже, чем незаряженный конъюгат 2,4Д. Константы диссоциации, определенные методом ELISA, для 2,4Д и его конъюгата составили соответственно 6*10-8 и 4*10-10. Был проведен виртуальный мутагенез по данной позиции и мутантный вариант Е50К был выбран для дальнейшего изучения.

Методом сайт-направленного мутагенеза рекомбинантном Fab-фрагменте антитела Е2/В5 была проведена замена Е50К. Полученный мутантный вариант был экспрессирован в периплазму клеток E.coli и выделен методом металлохелатной хроматографии.

Для данного варианта оказалось, что действительно удалось ухудшить связывание конъюгата в сравнении со свободным 2,4Д - константы диссоциации составили 2*10-8 и 4*10-7 соответственно. Показатель IC50 при этом несколько увеличился до 69 нг/мл против 8.2 нг/мл, характерных для исходного Е2/В5.

Таким образом, на основе теоретической модели антитела Е2/В5 проведен направленный мутагенез по сайту связывания гаптена. Было достигнуто целевое изменение соотношения констант диссоциации для свободного и связанного лиганда.

 

Колясников О.В.1, Синяева Ю.А.2, Григоренко В.Г.1

1Каф. Энзимологии, Химический факультет, МГУ им. Ломоносова (Россия)

2Биологический факультет, МГУ им. Ломоносова (Россия)