Вы здесь

Главная

Обнаружение конформационных изменений в белках по константе скорости кооперативного протеолиза

ID_Статьи: 
105.00

Основным методом обнаружения относительно устойчивых промежуточных структур при денатурации белков является сравнение кривых плавления (КП), полученных разными методами. Скорость ферментативного гидролиза высоко чув­ствительна к конформационным изменениям белкового субстрата. При коопера­тивном протеолизе его скорость описывается реакцией псевдо-первого порядка. Изменение константы скорости реакции может быть использовано для определе­ния КП белков. Было исследовано действие .мочевины на глицинин (запасной белок семян сои), лизоцим и бычий сывороточный альбумин (БСА).

Белки выдерживали в течение 16 часов в растворах мочевины при рН 8,2 и 20°С и гидролизовали папаином, который не инактивируется даже при высо­ких концентрациях мочевины. За ходом гидролиза следили по убыли белка.

Точки полупревращения КП, полученных по результатам гидролиза и флуорес­ценции глицинина, полностью совпадали (2,6 М), тогда как увеличение содержа­ния доступного тирозина происходило при значительно более высоких концентра­циях мочевины (точка полупревращения КП 5М). КП БСА и лизоцима. определен­ные по скорости протеолиза (точка полупревращения 2,5 и 5,6 М, соответственно), указывают на изменения в структуре этих белков, происходящие значительно раньше, чем изменения, обнаруживаемые по КП флуоресценции. Определенная последним методом точка полупревращения КП БСА равна 4,5 М, а у лизоцима она не достигается даже в 9,7 М мочевине. Величина изменения флуоресценции при этой концентрации составляет только 62% от максимальной, достигнутой в 6 М гуанидин хлориде. Таким образом, предложенный метод позволяет обнару­жить даже незначительные конформационные изменения, происходящие в белке при сравнительно низких концентрациях денатурирующего агента.

 

Морарь Д.Г.

Государственный университет Молдовы, Кишинев (Молдова)