Вы здесь

Главная

Новый метод очистки белка р32 бактериофага Т4

ID_Статьи: 
20.00

Продукт гена 32 бактериофага Т4 связывается с одноцепочечной ДНК при репликации, стабилизируя ее. Он играет также важную роль в процессах рекомбинации и репарации ДНК. Белок р32 широко используется при изучении ДНК-белковых взаимодействий и в электронной микроскопии, а также при синтезе ДНК по методу "катящегося кольца" (RCA - амплификация). Существующие методы очистки белка основаны на использовании панкреатической ДНКазы на стадии лизиса биомассы, что является неудобным, так как ДНКазу необходимо предварительно очищать от примесной протеазы, расщепляющей белок р32. Кроме того, необходима тщательная последующая очистка препарата белка от ДНКазы, поскольку он используется для экспериментов с одноцепочечной ДНК.

Мы предлагаем новую схему выделения белка р32. Ген белка был клонирован нами в экспрессионный вектор рЕТ 28Ь и экспрессирован в штамме E.coli Тор 10. Для осаждения нуклеиновых кислот после лизиса клеток мы использовали спермин (N.N'-1,4 бутандиамин), низкомолекулярный поликатионный реагент. Дальнейшую очистку белка проводили на колонках с ДЕАЕ-сефарозой, гепарин-сефарозой и фенил-сефарозой. В результате был получен электрофоретически гомогенный и активный белок р32. Активность проверяли по замедлению подвижности одноцепочечной ДНК фага М13 при связывании с белком р32 в агарозном геле на электрофорезе. По этому критерию выделенный нами белок не отличался от коммерческого белка фирмы Roche.

 

Зырина Н.В.1, Железная Л.А.1, Матвиенко Н.И.2

1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино (Россия)

2 Институт белка РАН, Пущино (Россия).