Вы здесь

Главная

Конструирование суперпродуцентов всех компонентов системы модификации-рестрикции типа IV, Bsplu11III

ID_Статьи: 
91.00

В 1995 г. в лаборатории Молекулярной Генетики Института Белка РАН в термофильном штамме Bacillus species LU11 была обнаружена система рестрикции-модификации (Р-М) BspLUMlll, относящаяся к редкому типу IV. Для эндонуклеаз рестрикции данного типа характерно уникальное сочетание метилтрансферазной и эндонуклеазной активностей в одной полипептидной цепи. Следует отметить, что до настоящего времени неизвестна пространственная структура ни одного фермента, принадлежащего к типу IV систем Р-М.

Исследование выделенных ферментов (эндонуклеазы рестрикции R.BspLU11III и двух метилтрансфераз N6-mA R.BspLU11IIIа и m5-mC R.BspLU11IIIb) показало, что они узнают непалиндромный пентануклеотид, который модифицируют следующим образом:

5"- GGGAC - 3'(R.BspLU11III, R.BspLU11II)/3"- CCCTG - 5" (M.Bsp.LU11IIIb).

Была определена нуклеотидная последовательность генов, кодирующих R.BspLU11III, и прилегающих к ним областей. Впервые для клонирования бактериальных метилтрансфераз был применён метод амплификации фрагмента гена с использованием вырожденных праймеров, соответствующих консервативным мотивам аминокислотной последовательности. Была создана генетическая констукция для экспрессии гена метилтрансферазы R.BspLU11III в Е. coli, на основе которой получен суперпродуцент. При экспрессии аналогичных конструкций для R.BspLU11III в Е. coli, соответствующие им белки получить не удалось, т.к. эти ферменты содержат более 40% кодонов, редких для Е. coli. Поэтому сначала наработка R.BspLU11III велась в Bacillus subtilis. Позднее, с помощью плазмиды pRARE, содержащей гены тРНК редких для Е. coli кодонов, удалось получить суперпродуцентов R.BspLU11III и R.BspLU11IIIb в Е. coli. Разработаны методики всех очистки компонентов системы рестрикции-модификации R.BspLU11III до гомогенного состояния, необходимого для получения кристаллов белка. Ведётся поиск условий кристаллизации.

 

Кириенко Н.В., Матвиенко Н.И.

Институт белка, Пущино (Россия).