Вы здесь

Главная

Конструирование противоракового гибридного белка анти-НЕR2/neu-миниантитело с барстаром

ID_Статьи: 
107.00

Направленная доставка противоопухолевых агентов непосредственно к ра­ковой клетке является одним из способов преодоления общей токсичности этих агентов для организма в целом, а также может служить основой для диагности­ки и локализации опухолей. В нашей лаборатории в качестве молекулы для такой направленной доставки был сконструирован рекомбинантный белок, со­стоящий из гуманизированного мини-антитела против распространенного ра­кового маркера HER-2/neu и небольшого белка барстара, ингибитора бактери­альной рибонуклеазы барназы. Для очистки рекомбинантного белка с помощью аффинной хроматографии, а также для последующего присоединения к нему радиоактивных изотопов на С-конец белка был введен олигогистидиновый фраг­мент. Синтезирующийся в клетках Е. coli целевой белок первоначально выде­ляли в растворимом виде из периплазматического пространства и очищали на колонке с никелевым сорбентом. Однако выход белка был невысок, он быстро выпадал в осадок и отвечал не всем требованиям в качестве молекулы для направленной доставки противоопухолевых агентов.

С целью оптимизации биосинтеза в Е. coli гибридного белка анти-HER-2/neu-барстар была проведена модификация генно-инженерных конструкций, на­правляющих его биосинтез, подбор бактериальных штаммов для экспрессии, а также условий их культивирования и индукции. Наибольший выход целевого белка дала конструкция на основе вектора рАТ115 после трансформации клеток Е. coli XLlBlue. Биосинтез целевого белка под контролем /ас-промотора инду­цировали IPTG при плотности клеточной культуры А450 0,3. Белок, несущий в этом случае олигогистидиновый фрагмент на N-конце, выделяли из телец вклю­чения с помощью специально разработанной методики денатурации в 6 М гуанидинхлориде и последующей ренатурации непосредствено на колонке с нике­левым сорбентом. Был разработан также метод выделения и очистки гибридно­го белка анти-HER-2/neu-барстар без олигогистидинового фрагмента на нике­левой колонке с предварительно сорбированным гибридным белком анти-HER-2/neu-барназа. В этом случае целевой белок анти-НЕР-2/neu-барстар выделя­ли в виде одной из двух составных частей бифункционального противораково­го мини-антитела. Предварительные эксперименты показали, что обе части гиб­ридного белка сохраняют способность взаимодействовать со своими лигандами как до, так и после связывания с радиоактивным изотопом технеция-99т.

 

Муреев С.В., Лебеденко Е.Н., Лукаш С.В., Деев С.М.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

РАН, Москва