Вы здесь

Главная

Конструирование мобилизуемых инсерционных модулей для клонирования фрагментов бактериальной ДНК

ID_Статьи: 
34.00

Транспозоновый Тп5 -Mob-мутагенез позволяет маркировать крупные плазмиды почвенных бактерий в разных локусах и придавать им способность к мобилизации на перенос в клетки Е. coli. В клетках кишечной палочки эти

плазмиды не поддерживаются. Встроив в состав транспозона Tn5-Mob энтеробактериальный плазмидный ориджин репликации р15А или ColEl, можно предоставить перенесенному материалу шанс сохраниться вместе с прилегающими к месту инсерции областями после делеций до приемлемых размеров. Т.е. получить, таким образом, инструмент для клонирования ДНК - мобилизуемый инсерционный модуль, способный к автономной репликации.

Конструирование транспозона Tn5-Mob-Ori осуществляли следующим путем. Из транспозона Tn5-B 12S вырезали по BamHl-сайту кассету nptl-sacB-sacR и на ее место встраивали плазмиду р15 SK(-). Полученную конструкцию электропорацией вводили в клетки кишечной палочки. Плазмида с транспозоном Tn5-Mob-Ori стабильно поддерживалась. Получали также варианты конструкции с ColEl ориджином репликации. Конструкции опробуются при инсерционном мутагенезе различных грамотрицательных бактерий. Процедура клонирования прилегающих к транспозону участков ДНК крупных плазмид с помощью Tn5-Mob-Ori состоит из нескольких последовательных скрещиваний и не предусматривает каких-либо манипуляций с ДНК in vitro. Ее этапы: 1) Получение Tn5-Mob-Ori мутантов исследуемого штамма, 2) Введение мобилизующей плазмиды RP4-4 в клетки мутантов, 3) Мобилизация мутагенизированной плазмиды в клетки Е. coli и отбор полученных делеционных производных.

 

Беликов В.А.1,3, Улитин А.Б.3, Широков А.А2., Шелудько А.В.1, Мозжилина О.Г.2, Чернышев С.В.3

1Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов,

2Саратовский государственный университет, Саратов,

3Филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино.