Вы здесь

Главная

Клонирование, секвенирование и получение суперпродуцента новой сайт-специфической никазы BspD6i

ID_Статьи: 
39.00

Сайт-специфические никазы недавно открытый класс ферментов, которые узнают на двухцепочечной ДНК короткую специфическую последовательность (сайт) и вносят разрыв (ник - nick) только в одну, определенную цепь ДНК на фиксированном расстоянии от сайта. Эта их особенность представляет интерес для структурных исследований, а также создаёт предпосылки для создания новых методов молекулярной биологии. На сегодняшний день известно 4 сайт-Специфические никазы, выделенные из природных штаммов, одна из которых, никаза BspD6l, найдена и охарактеризована нами ранее. Было показано, что она узнает сайт GAGTC и вносит ник на расстоянии 4 н.о. от сайта узнавания.

Определение последовательности гена никазы проводилось с использованием вырожденых ДНК-зондов, соответствующих наиболее консервативным областям предполагаемых гомологов. Затем с использованием точных праймеров была установлена вся последовательность гена никазы, а также прилегающие к Зу- и 5у-концам гена области. Общая длина секвенированной ДНК - 3200 н.о. Ген никазы BspD6l был клонирован в экспрессионный вектор рЕТ28Ь. Для экспрессии никазы мы использовали штамм E.coli ToplOFy (mrr mcr), который не ограничивает метилированную ДНК. Штамм с такими свойствами необходим был для того, чтобы предварительно трансформировать его плазмидой, несущей ген метил азы MJSschlL Этот фермент узнаёт сайт GANTC, а значит может защитить клеточную ДНК от токсичного действия никазы. Таким образом, штамм-продуцент содержал две плазмиды: pl5SK с метилазным геном под собственным промотором и рЕТ28Ь с геном никазы под контролем Т7-промотора. Поскольку штамм ToplOFy не содержит гена РНК полимеразы Т7, индукция экспрессии проводилась с помощью фага 1СЕ6, несущего ген Т7 РНК полимеразы. Никаза BspD6l получена в функционально чистом состоянии.

 

Рогулин Е.А.1, Перевязова Т.А.1, Бубнова О.А.2, Железная Л.А.1

1 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия

2 Институт белка РАН, Пущино, Россия