Вы здесь

Главная

Клонирование гена новой полинуклеотидлигазы бактериофага Т4, создание суперпродуцента, получение и исследование гомогенного нативного фермента

ID_Статьи: 
43.00

Ранее было известно, что бактериофаг Т4 кодирует две полинуклеотидлигазы. Одна из них - продукт гена 30 - ДНК-лигаза. Другая - продукт гена 63, который является РНК-лигазой и одновременно служит структурным компонентом базальной пластинки бактериофага. Оба фермента способны к лигированию не только своих канонических, но и альтернативных субстратов: в случае Gp30 это цепи рибонуклеотидов, в случае Gp63 -дезоксирибополинуклеотиды. В ходе анализа и реаннотирования области генома бактериофага Т4 uvsW-segD найдено сходство полипептида, кодируемого открытой рамкой считывания 24.1, с РНК-лигазами митохондрий паразитических простейших, участвующими в редакции матричных РНК. Этот процесс приводит к появлению новых инициирующих и/или стоп-кодонов в матричной РНК.

Одновременно с нашей работой рядом авторов в 2002 году было обнаружено, что ген данной предполагаемой РНК-лигазы является ранним геном, хотя находится в окружении поздних генов бактериофага (Virology 299,182-191,2002). Также было показано, что рекомбинантный фермент с добавлением шести гистидинов к N-концу бежа способен к лигированию рибоолигонуклеотидов (PNAS, 99, 12709-12714, 2002). ОРС 24.1 была клонирована нами в составе ПЦР-фрагмента ДНК в вектор для суперпродукции рЕТ15Ь. Были проведены опыты по индукции экспрессии этого гена в клетках штамма E.coli BL21 (ВЕЗ) с помощью ИПТГ. Фермент накапливался в клетках до 30% от белка клетки. Gp24.1 был очищен до гомогенного состояния с помощью ионообменной хроматографии. Было показано, что короткие дезоксирибоолигонуклеотиды могут быть сшиты очищенным ферментом. Исследуются условия лигирования более протяженных фрагментов ДНК. Путем сравнения с базами данных было показано, что ряд белков, кодируемых E.coli и плазмидами имеет сходство с другими субъединицами РНК-редактирующего комплекса митохондрий одноклеточных паразитов. Это позволяет предполагать, что данный фермент может выполнять РНК-редактирующую функцию только в штаммах, содержащих плазмиды. В бесплазмидных штаммах он мог бы функционировать и как ДНК-лигаза, репарирующая одноцепочечные разрывы в ДНК в процессе развития бактериофага.

 

Савельева Н.В., Ванькова О.E., Шляпников М.Г., Зимин А.А.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино на Оке, Московской области, Россия.