Вы здесь

Главная

Изучение влияния на рефолдинг пероксидазы ее взаимодействия со специфическими антителами

ID_Статьи: 
17.00

С использованием панели полномерных антител и миниантител к различ­ным эпитопам пероксидазы исследована зависимость между специфичностью антител и их влиянием на рефолдинг. Проведен сравнительный анализ связы­вания полученных клонов с различными структурными вариантами пероксида­зы и предварительная оценка кинетических и равновесных констант связыва­ния с нативной пероксидазой. Методом ИФА проанализирована природа сай­тов связывания пероксидазы антителами различных клонов. Изучение антите­ло-зависимого рефолдинга пероксидазы проводили в системе с обработкой фермента 6,5 М гуанидингидрохлоридом и последующей ренатурацией разбав­ленного препарата. Разработаны системы кинетического контроля восстанов­ления активности пероксидазы при рефолдинге с использованием в качестве субстратов 2,2'-азинодиэтилбензтиазолинсульфоната и о-дианизидина. Прове­рено влияние всех полученных клонов на активность нативной пероксидазы. Отобраны антитела, которые активируют пероксидазу и при этом повышают выход ренатурированного фермента. Антитело HI увеличивало выход нативно-го, каталитически активного фермента в 1,6 раза. В то время как авторефолдинг пероксидазы в стандартных условиях приводил к восстановлению только 20% от исходной каталитической активности, антитело-ассистированный рефолдинг увеличивал выход до 30-35% при эквимолярном отношении антигенгантите-ло. Помимо этого, антитело HI увеличивает активность нативного фермента в 1,16 раза при 2-кратном мольном избытке ив 1,74 раза при 50-кратном избыт­ке. Динамика восстановления пероксидазной активности не отличалась для случаев авторефолдинга и антитело-ассистированного рефолдинга. Проведено экспериментальное изучение антитело-ассистированного включения гема в восстановленную белковую глобулу апопероксидазы как процесса, обуславлива­ющего антитело-ассистированный рефолдинг фермента.

 

Безсуднова Е.Ю.

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва