Вы здесь

Главная

Изучение функциональности сигналов внутриклеточного сортинга PR белков в клетках табака и актинидии на примере хитиназы Arabidopsis thaliana и суперсладкого белка тауматин II Thaumatococcus danielli

ID_Статьи: 
62.00

Изучение уровня экспрессии, стабильности и биологической активности гетерологичных белков в трансгенных растениях является одним из актуальных направлений современной генетической инженерии растений. Фенотипическое проявление активности гетерологичных белков зависит от внутриклеточной локализации. Она определяется регуляторными и сигнальными последовательностями, которые, например, определяют характер экспрессии, влияют на стабильность мРНК, корректный фолдинг белка и т.д. Данная работа посвящена изучению сигналов внутриклеточного сортинга PR белков на примере лидерных последовательностей генов хитиназы Arabidopsis thaliana и суперсладкого белка тауматин II Thaumatcfcoccus danielli. Для трансформации использовали бинарный вектор pBIN35SmGFP5ER, Т-ДНК которого содержит под контролем 35S промотора репортерный ген gfp фланкированный с N - конца лидерной последовательностью хитиназы, а с С - конца последовательностью кодирующей тетрапептид HDEL обеспечивающий локализацию в ЭПР. Получено 6 линий табака и 7 линий актинидии. Проведена трансформация бинарным вектором pGAGFPAFVY, содержащим в Т-ДНК репортерный ген gfp фланкированный с N-конца лидерной последовательностью хитиназы, с С - конца последовательностью кодирующей тетрапептид AFVY, обеспечивающий вакуолярную локализацию белка. С помощью этого вектора получено б линий табака и 8 линий актинидии. Интродукция гена gfp подтверждена ПЦР анализом, экспрессия GFP флюоресцентной микроскопией. Количественный анализ экспрессии GFP-флюориметрическим методом показал, что во всех отдельных линиях табака и актинидии, полученных, используя вектор pBIN35SmGFP5ER, уровень аккумуляции GFP в 2-3 раза выше. С использованием флюоресцентной микроскопии определили корректность работы выбранных сигналов внутри­клеточного сортинга в табаке и актинидии, что позволит в дальнейшем использовать их для модификации целевых генов. На основе сигнальных последовательностей тауматина созданы две конструкции pBIGFPTN и pBIGFPTNC с секреторной и вакуолярной формами GFP. В данный момент проводится агробактериальная трансформация табака и актинидии этими конструкциями.

 

Пущин А.С., Шестибратов К.А., Долгов С.В.

Филиал Института биоорганической химии РАН им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино (Россия)