Вы здесь

Главная

Исследование направленного внесения мутаций с помощью производных олигонуклеотида

ID_Статьи: 
118.00

Сайт-направленная коррекция поврежденных в результате мутаций генов является одной из важных проблем молекулярной биологии. В последние годы была предложена новая стратегия введения направленных мутаций, основанная на использовании РНК/ДНК гибридных молекул. При использовании подобных структур возможно эффективно заменять определенные нуклеотиды в ДНК. Позже было показано, что одноцепочечные производные олигонуклеотидов, могут вносить мутации даже более эффективно, чем первоначально предложенная РНК/ДНК конструкция.

Нами проведено исследование эффективности внесения одноосновных за­мен синтезированными производными олигонуклеотидов, содержащих фосфо-ротиоатные связи на обоих концах молекулы. Производные олигонуклеотидов созданы на основе олигонуклеотида AGCGACCCCTTACTTCGTCCGGTGC, выб­ранного таким образом, чтобы вызывать мутацию G—»А, которая приводит к замене Glu--»Lys в Mg-связывающем сайте белка и таким образом вызывает к потерю ферментативной активности. Реакция сайт-направленного мутагенеза проводилась в клеточном экстракте клеток КВ. Эффективность введения на­правленных мутаций проверялась на модельной системе содержащей вектор, кодирующий Я-галактозидазу под контролем SV 40 промотора. Частота генной конверсии определялась с помощью бело-голубой селекции. Замены в составе клонов с измененным фенотипом подтверждалась прямым секвенированием.

 

Олейникова С.Б., Синяков А.Н., Черноловская Е.Л., Власов В.В.

Институт биоорганической химии СО РАН, Новосибирск