Вы здесь

Главная

Использование ДНК-шаффлинга для получения химерных конструкций генов альфа- и бета-ЦГТаз

ID_Статьи: 
102.00

Циклодекстрины (ЦД) - уникальные соединения, образующие комплексы-включения с различными органическими молекулами и имеющие большое прак­тическое значение. Фермент циклодекстрин глюканотрансфераза (ЦГТаза) ка­тализирует превращение крахмала в ЦД трех типов: а-, b- и у-, состоящие из 6, 7 и 8 остатков глюкозы. ЦГТазы найдены у почвенных микроорганизмов, различ­ные штаммы которых нарабатывают смесь всех трех ЦД в разных пропорциях. Значительный интерес представляет обнаружение или искусственное получе­ние ЦГТаз, продуцирующих преимущественно один тип ЦЦ.

Цель работы: получение химерных конструкций генов ЦГТаз, нарабатываю­щих максимальное количество одного из типов ЦД методом ДНК-шаффлинга, основанного на комбинировании случайным образом полученных фрагментов генов двух гомологичных белков в процессе двухраундовой амплификации. Секвенированные нами гены бациллярных а- и Р-ЦГТаз, клонированные в pBluescri.pt II SK,имеют гомологию на куклеотидном уровне 62%. ДНК гена (3-ЦГТазы переклонировали в вектор с противоположной ориентацией полилин­кера. Одноцепочечные ДНК обоих генов обработали ДНКазой до образования фрагментов размером 200-300 п.н. В первом раунде шаффлинга провели бес-праймерную ПЦР смеси одноцепочечных фрагментов обоих генов с использо­ванием Taq- и Рш-полимераз. Полученный набор продуктов ПЦР подвергли второму раунду шаффлинга с праймерами для секвенирования с целью ампли­фикации восстановленного полноразмерного гена. Продукты второго раунда клонировали по сайтам рестрикции в Е. coli (штамм XLl-Blue) и трансфор­манты высевали на среду LB с крахмалом. Среди них йодным тестом выявля­ли клоны, обладающие способностью гидролизовать крахмал. Клоны, обладаю­щие ЦГТазной активностью, отбирались для определения специфичности дей­ствия полученных ЦГТаз с целью обнаружения при помощи секвенирования новообразованных нуклеотидных последовательностей.

 

Мингазетдинова С.Р., Бикбулатова С.М., Чемерис А.В., Вахитов В.А.

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, Уфа