Вы здесь

Главная

Хоминг-эндонуклеаза segB фага Т4: биохимические свойства

ID_Статьи: 
182.00

Ген segB расположен в кластере генов тРНК фага Т4 и кодирует сайт-специфическую эндонуклеазу, относящуюся к GIY-Y1G семейству хоминг-эн-донуклеаз. В данной работе ген segB клонирован и экспрессирован в Е. coli, и получен очищенный препарат кодируемой им эндонуклеазы. Для изучения распространения гена segB среди бактериофагов Т4-типа был проведен ПЦР-анализ кластера генов тРНК фагов T2L, Т6, RBI, RB2, RB3, RB6, RB7, RB8, RB9. На основании результатов ПЦР, а также данных по секвенированию данной об­ласти генома фагов RB1 и RB3, определено, что ген segB отсутсвует у всех исследованных фагов. Анализ эндонуклеазной активности in vitro показал наличие предпочтительного сайта гидролиза SegB в области генов тРНК фагов RB1 и RB3. Определены оптимальные условия работы эндонуклеазы SegB. Фермент наиболее активен в щелочных значениях рН, с максимумом при рН 8.5, оптимум концентрации ионов Mg2+ составляет 10мМ, Наличие монова­лентных катионов (Na+, К+) в реакционной смеси приводит к снижению об­щей активности фермента. Температурный оптимум для SegB находится в области 30-35°С. Показано, что БСА, а также неионные детергенты, такие как Triton Х-100, NP-40, Thesit и Tween20 оказывают стабилизирующее действие на фермент.

Для изучения частоты встречаемости сайтов узнавания эндонуклеазы SegB в геномах бактерий был проведен гидролиз ДНК Е. coli С600 и P. aeruginosa РА01, различающихся GC-составом. Полученые данные свидетельствуют о на­личии множественных участков узнавания SegB в геномных ДНК этих бакте­рий. Введение в хромосому P. aeruginosa двух сайтов гидролиза из бактерио­фага RB1, расщепление такой ДНК SegB и последующий анализ не позволил обнаружить предпочтительность SegB в выборе сайтов гидролиза. Результаты исследования позволяют сделать вывод о низкой специфичности эндонуклеазы SegB, что, по-видимому, связано с высокой вырожденностью сайтов узнавания этого фермента.

 

Хольшева B.C., Колосов П.М., Телегин М.А., Шляпников М.Г., Грановский И.Э.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Пущино