Вы здесь

Главная

Есo29ki : альтернативная организация каталитического центра эндонуклеаз рестрикции типа II

ID_Статьи: 
75.00

Одной из фундаментальных задач молекулярной биологии является исследование молекулярных механизмов каталитической активности наиболее специализированных белков - ферментов. Привлекательной моделью для такого рода исследований являются сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции типа II (ССЭРII), имеющие широкое применение в практике генной инженерии, биотехнологии и структурных исследованиях ДНК.

Целью настоящей работы явилось изучение структурной основы каталитической активности ЭР типа II Есо29Ш, обнаруженной ранее в нашей лаборатории в клиническом изоляте E.coli - 29к1. Проведенный сравнительный анализ аминокислотных последовательностей позволил обнаружить в R£co29kI мотив GIY-YIG, входящий в каталитический домен интронных эндонуклеаз, и тем самым определить в молекуле R2sco29kI аминокислотные остатки, входящие, предположительно, в каталитический центр этого фермента: Y49, Y76, R104, HI08, Е142 и N154. Для проверки участия выявленных аминокислот был проведен олигонуклеотид-направленньш мутагенез in vitro генаесо29кП1. В результате, кодоны, кодирующие возможные функциональные аминокислоты были заменены на аланиновые триплеты.

Очищенные на металл-хелатной колонке продукты мутантных генов не гидролизуют ДНК по специфическим сайтам узнавания, при этом сохраняется их способность к специфическому связыванию с ДНК как в присутствии Mg2+, так и в их отсутствие. Сходные данные по связыванию получены и для нативной формы REco29kl. Эта особенность характерна только для интронных эндонуклеаз и немногочисленных ЭР, относящихся к типу lis.

Изучение свойств мутантных форм ЭР Eco29kl подтвердило гипотезу, что этот белок имеет конформацию каталитического центра, альтернативную всем ранее исследованным ЭР. Полученные данные позволяют говорить о филогенетической связи ЭР Eco29kI с интронными эндонуклеазами, которые участвуют в процессах генетического обмена у бактерий и высших организмов.

 

Ибряшкина Е.М., Захарова М.В., Деньмухамедов М.М., Солонин А.С.

Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Т.К. Скрябина, Пущине (Россия)